Technische Universität München - Wissenschaftszentrum Weihenstephan - Forschungsdepartment Biowissenschaftliche Grundlagen - Lehrstuhl für Mikrobiologie - FG Mikrobielle Biotechnologie
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22007913

01.09.2014

Um Regulatoren zu identifizieren, die in M. luteus die Bildung verzweigter Olefine über den Ole-ABCD-Weg beeinflussen, wurden fast 80 potentielle regulatorische Gene erfolgreich inaktiviert. RNAseq-Daten ausgewählter Mutanten zeigten die Rolle von Aminosäureabbau und Fettsäureme-tabolismus auf und konnten letztlich genutzt werden, um die Olefinbiosynthese in M. luteus zu ma-nipulieren. In verschiedenen Bakteriengattungen der Familie Micrococcales wurden erstmals Ole-fine nachgewiesen. Das durch M. luteus nutzbare Substratspektrum konnte mittels Gentechnik um Stärke als neue Kohlenstoffquelle erweitert werden. Durch die chromosomale Inaktivierung bestimmter Regulatorgene, die Überexpression der ole-ABCD-Gene, oder das Einfügen stärkerer Promotoren vor ausgewählte Gene im Fettsäurestoffwechsel bzw. Aminosäurekatabolismus, wurde eine Steigerung der Olefinbildung beobachtet. Durch das Kombinieren vorteilhafter Mutationen konnte in Komplexmedium eine 7,5-fach Steigerung und in Minimalmedium eine 13,6-fache Steigerung der Olefinproduktion erreicht werden. Durch die Supplementierung mit Vorläufern der Fettsäure- bzw. Olefinsynthese und durch Expres-sion von heterologen OleA-Genen aus Micrococcus-, Kocuria- und Kytococcus-Stämmen in M. luteus konnten Olefine mit abweichender Kettenlängen- und Isomerenverteilung hergestellt werden. Zweiphasenfermentationen mit Octan als organischer Phase weisen auf eine Olefinextrahierbarkeit während der Kultivierung hin. Sowohl durch weiteres metabolisches Engineering und/oder Zuführung bestimmter Vorläufermole-küle von außen, als auch durch die Optimierung der Extraktion während der Kultivierung sollten noch weitere Verbesserungen der Olefinproduktion möglich sein.

Die Entwicklung von Biokraftstoffen, die vorwiegend aus Kohlenwasserstoffen bestehen und deshalb völlig kompatibel sind mit der vorhandenen Infrastruktur für flüssige fossile Kraftstoffe, ist derzeit von großem Interesse. Manche Bakterien synthetisieren natürlicherweise Kohlenwasserstoffe und könnten interessante Produktionsorganismen für die biotechnologische Herstellung dieser Verbindungen darstellen. Bisher ist allerdings wenig über deren Biosynthesemechanismen bekannt, zudem verhinderte das Fehlen von genetischen Methoden Ansätze zur Steigerung der Olefinproduktion in solchen Bakterien. In diesem Vorhaben sollen gentechnisch modifizierte Stämme von Micrococcus und ggf. anderen Bakterien für die direkte Produktion von Kohlenwasserstoffen durch einstufige Fermentation aus nachhaltig verfügbaren Kohlenstoffquellen entwickelt werden. Den Schwerpunkt der geplanten Arbeiten bildet die Entwicklung von Micrococcus-Stämmen für die Herstellung von Monoketonen und Olefinen. Unter Einsatz von in unserer Arbeitsgruppe verfügbaren genetischen Werkzeugen für Mikrokokken sollen Modifikationen einerseits an einzelnen Biosyntheseenzymen und andererseits an Stoffwechselwegen eingeführt und deren Einfluss auf die Produktbildung qualitativ und quantitativ untersucht werden. Aspekte, die im Rahmen des Projekts bearbeitet werden sollen, sind die Suche nach neuen Genen für Kohlenwasserstoffbiosyntheseenzyme, die Untersuchung der Regulation der Kohlenwasserstoffbiosynthese in Micrococcus, die Erweiterung des Substratverwertungsspektrums und die Entwicklung einer Methode zur Abtrennung der gebildeten Kohlenwasserstoffe aus Produktionskulturen.