Universität Stuttgart - Fakultät für Chemie - Institut für Biochemie und Technische Biochemie (IBTB)
Allmandring 31
70569 Stuttgart

22030805

01.09.2006

Ziel des Teilvorhabens war die Untersuchung der enzymatischen Oxidation von Fettsäuren mit P450 Monooxygenasen. Dabei stand die Hydroxylierung von gesättigten Fettsäuren bzw. die Veränderung der Hydroxylierungsposition im Vordergrund. Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYP) können molekularen Sauerstoff unter Aufnahme von zwei Elektronen aktivieren, wodurch ein Sauerstoffatom auf ein Substrat-Molekül übertragen wird. Die CYP102A-Enzyme und CYP152A1 unterscheiden sich in der Regioselektivität der katalysierten Hydroxylierung. Während CYP102A-Enzyme Fettsäuren in subterminalen Positionen (omega-1 bis omega-3) hydroxylieren, erfolgt durch CYP152A1 die Hydroxylierung in alpha- und beta-Position. Die Verschiebung der Hydroxylierung der Capryl-, Caprin- und Laurinsäure nach gamma- und delta-Position würde in Hydroxysäuren resultieren, die direkte Vorläufer von Lactonen darstellen. Lactone sind interessante Geruchs- und Aromastoffe mit fruchtigem Charakter (Pfirsich, Kokosnuss). Für CYP152A1 wurden mit Hilfe des rationalen Protein-Designs verschiedene Mutanten erstellt, die eine im Vergleich zum Wildtyp veränderte Fettsäurebindestelle enthalten. Um die Regioselektivität der Fettsäurehydroxylierung von omega-1- bis omega-3-Position in Richtung gamma- und delta-Position zu verschieben, wurden Methoden der gerichteten Evolution und des rationalen Protein-Designs angewendet. Mit Hilfe eines in der Arbeit entwickelten Assays, mit dem über 6000 Mutanten analysiert wurden, war es nicht möglich eine wesentliche Verschiebung im Vergleich zum Ausgangsenzym zu erhalten. Allerdings wurden durch rationales Protein-Design Positionen identifiziert, die für eine zielgerichtete Veränderung des Produktmusters vorteilhaft sind. Mit der Mutante S72Y V78A F87A wurden, gemessen am Gesamtprodukt, 16% delta-, 5% gamma- und 9% beta-Hydroxylaurinsäure erzeugt.

Aufgrund der positiven Ergebnisse der ersten Förderphase (FKZ: 22000504 (04NR005)) wird eine zweite, ebenfalls achtzehnmonatige Förderperiode beantragt. Das Gesamtziel des Vorhabens ist die Herstellung vonRiech- und Aromastoffen des Lacton-Typs aus Ölen einheimischer Nutzpflanzen mittels regio- und stereoselektiver enzymatischer Oxidation mittel- und langkettiger Fettsäuren. Zum Einsatz kommen P450 Monooxygenasen, die im Institut für Technische Biochemie, Stuttgart mit molekularbiologischen Methoden erzeugt und auf die gewünschten Reaktionen und spezifischen Anforderungen des geplanten Verfahrens hin optimiert werden. Cytochrom P450 Monooxygenasen sollen in einem elektrochemischen Enzymreaktor eingesetzt werden. Die in der ersten Förderperiode hergestellten P450 Monooxygenasen werden weiter optimiert und auf die Stereoselektivität geprüft. Mutantenbibliotheken werden mithilfe des hergestellten Surrogatsubstrats gescreent. Eine Publikation ist in Vorbereitung. Eine Patenetanmeldung folgt.