DECHEMA Gesellschaft für Chemische Technik und Biotechnologie e.V. - Karl-Winnacker-Institut - Arbeitsgruppe Bioverfahrenstechnik
Theodor-Heuss-Allee 25
60486 Frankfurt am Main

22030905

01.09.2006

Die Hauptaufgabenstellung war die Untersuchung der grundsätzlichen Machbarkeit einer elektrochemischen Kopplung von Fettsäure-hydroxylierenden Cytochrom P450 Monooxygenasen. Der Enzymeinschluss in leitfähige Polymere wurde hinsichtlich der angestrebten Umsetzung von Fettsäuren untersucht. Mit den bisherigen Untersuchungen wurde die Machbarkeit der Substitution des Cofaktors NADPH durch die Immobilisierung einer P450 Monooxygenase BM-3 in einem leitfähigen Pyrrolpolymer und der Anwendung der Bioelektrokatalyse gezeigt. Damit konnte das Ziel "Katalytisch aktive Monooxygenasen P450 BM-3 bei Kopplung mit einem elektronenliefernden elektrochemischen System" erreicht werden, da sich hierdurch die Möglichkeit des vollkommenen Verzichtes auf den kostspieligen Cofaktor NADPH abzeichnet. Zur Optimierung der Anbindung von P450 Monooxygenasen an leitfähige Polymere wurden verschiedene Verfahren untersucht; potentialabhängige Adsorption der Enzyme an einem leitfähigen Polymer, reversible Anbindung von Nickel-Ionen durch potentialabhängige Adsorption an einem leitfähigen Polymer und nachfolgende Bindung der Enzyme an das Nickel über ein Affinitätsmarker sowie die reversible Anbindung der Enzyme an das leitfähige Polymer über einen Affinitätsmarker des Enzyms an, in Polypyrrol eingebettes, Nickel. Weiterhin wurden Kohlenstoffvliese auf ihre Eignung als Elektrodenmaterial für das Scale-up untersucht. Basierend auf diesen Elektroden wurde ein Verfahrensschema für die elektro-enzymatische Hydroxylierung von Fettsäuren mit P450 Monooxygenasen entwickelt. In das Reaktorkonzept wurde eine online Analytik der Enzymaktivität mittels optischer Sensoren integriert. Zusammenfassend haben die bisherigen Untersuchungen die generelle Anwendbarkeit der Immobilisierung von Enzymen an bzw. in leitfähigen Polymeren und die elektrochemische Kopplung der Fettsäure-hydroxylierenden Cytochrom P450 Monooxygenasen an das leitfähige Polymer gezeigt.

Das Gesamtziel des Vorhabens ist die biokatalytische Herstellung von Riech- und Aromastoffen des Lacton-Typs aus Ölen vornehmlich einheimischer Nutzpflanzen. Im Rahmen der ersten 18-monatigen Förderphase wurden molekularbiologisch neue Cytochrom P450-Varianten erzeugt, deren Regioselektivität in Richtung der lactonrelevanten Hydroxylierungspositionen verschoben werden konnte. Im Folgevorhaben soll die Hydroxylierung bis zur erwünschten gamma- und delta-Position der Fettsäuren verlagert werden. Des weiteren konnte die prinzipielle Machbarkeit einer in vitro Biokatalyse durch elektrochemische Kopplung der P450 Monooxygenasen aufgezeigt werden. Diese Ergebnisse sind im Folgevorhaben mit Fettsäuren als Substrat zu validieren und auf einen neukonzipierten Laborenzymreaktor zu übertragen. Das Enzymdesign wird weiterhin an der Universität Stuttgart und die Bioelektrokatalyse bei der DECHEMA e.V. durchgeführt. Die Symrise GmbH führt begleitende analytische, synthetische und mikrobiologische Arbeiten durch. Gegen Ende der 18 Monate werden die erzielten Ergebnisse und das Potential zur mittelfristigen Übertragung des neuartigen Biokatalyseprinzips in die industrielle Anwendung evaluiert.