Prof. Dr. Klaus-Dieter Vorlop
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31.07.2002

niedermolekulare Kohlenhydrate effektiv zur 1,3-Propandiol-Bildung umsetzt. Der Grundgedanke des Vorhabens ist das Umleiten von Glykolyse zur 1,3-PD-Bildung, indem das Enzym Trioephosphat-Isomerase (TIM) inaktiviert wird (tpi-Mutante). Das Enzym stellt einen zentralen Schalthebel zwischen Glykolyse und 1,3-PD-Bildung dar. Es wurde in vier Schritten vorgegangen: Es wurden Primer-Paare entwickelt, mit denen es möglich wurde, aus einem breiten Spektrum von Bakterien in kürzester Zeit homologe tpi-Sonden herzustellen. Als geeigneter Kandidat für die TIM-Inaktivierung wurde das Bakterium Clostridium butyricum ausgewählt. Dieses bildet 1,3-PD aus Glycerin. Aus der genomoschen DNA von C. butyricum wurde eine tpi-Sonde hergestellt. Aus dem Genom von C. butyricum wurde eine genomische Bank konstruiert, mit der tpi-Sonde gescreent und tpi-tragende Klone isoliert sowie charakterisiert. Die Authentizität des tpi-Gens wurde nachgewiesen: Das isolierte tpi-Gen stammt eindeutig aus dem Genom von C. butyricum und kommt als "single-copy-gene" vor. Die insertionale Mutagenese resultiert aus einer komplexen gentechnischen Konstruktion. Das Schlüsselkonstrukt pMSTimKSP wurde nukleotidgenau zusammengebaut, sequenziert und auf seine Eigenschaften geprüft. Es erfüllt alle notwendigen Bedingungen für die Transformation und homologe Rekombination. Das inaktivierte tpi-Gen wurde nach einer transformation in das Wildtyp-Genom integriert und tpi-Mutanten erzeugt. Der Erfolg der insertionalen Mutagenese wurde eindeutig bewiesen, womit die Erzeugung einer tpi-Mutante erreicht wurde. Physiologische Untersuchungen zeigten, dass alle tpi-Mutanten (wie erwartet) unfähig sind Glycerin zu verwerten. Jedoch sind die tpi-Mutanten sehr fragile und es ist nicht gelungen, die tpi-Mutanten in ausreichender Menge über mehrere Generationen am Leben zu erhalten und zu 1,3-PD-Bildung zu veranlassen.

1,3-Propandiol ist ein interessanter Grundstoff für neuartige Polymere. 1,3-Propandiol wird von verschiedenen Mikroorganismen fermentativ aus Glycerin gebildet. Die derzeit erreichbaren Produktivität liegt bei Einsatz von immobilisierten Zellen im Bereich von 30 g 1,3-PD aus einem Liter Medium pro Stunde. Voraussetzung für eine wettbewerbsfähige Umsetzung dieses Verfahrenswegs in den industriellen Maßstab ist ein kostengünstiges Ausgangsmaterial. Anbieten würden sich in diesem Zusammenhang niedermolekulare Kohlenhydrate. Ihre Verfügbarkeit als nachwachsende Rohstoffe und ihr niedriger Preis machen sie zu idealen Rohstoffen für die 1,3-PD-Produktion. Allerdings ist ein Organismus, der 1,3-PD in signifikanten Mengen direkt aus Zucker bildet, aus der Natur bisher nicht bekannt. Deshalb soll im Rahmen des Vorhabens ein Organismus, der 1,3-PD aus Glycerin bilden kann, gentechnisch so verändert werden, daß er 1,3-PD auch effektiv aus Zucker produziert.