Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe Ein Projektträger des Bundesministeriums für Ernährung und Landwirtschaft

 

Projektverzeichnis - Details

Verbundvorhaben: Bio- und chemokatalysierte Wege zu funktionalisierten Glycerinderivaten (MetaGlyc 2); Teilvorhaben 5: Protein-Engineering von Enzymen und enzymatische Umesterungen

Anschrift
Universität Greifswald - Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät - Institut für Biochemie
17489 Greifswald
Felix-Hausdorff-Str. 4
Kontakt
Prof. Dr. Uwe Bornscheuer
Tel: +49 3834 86-4367
E-Mail: uwe.bornscheuer@uni-greifswald.de
FKZ
22005311
Anfang
01.09.2011
Ende
31.08.2014
Aufgabenbeschreibung
Auf der Basis der Strukturinformationen aus der kürzlich veröffentlichten Proteinkristallstruktur der Lipase A aus Candida antarctica (CAL-A) soll dieses Enzym gezielt über Protein-Engineering optimiert werden. Ziel ist die Veränderung der Fettsäurespezifität und der Alkoholbindetasche zur Etablierung effizienter Biokatalysatoren. Die erhaltenen CAL-A-Varianten sollen zur Abreicherung von gesättigten Fettsäuren aus Ölen oder auch zur Umesterung von natürlichen Ölen mit interessanten Alkoholkomponenten eingesetzt werden. Im Rahmen des Projekts wird der AK Bornscheuer die Expression rekombinanter CAL-A in E. coli bzw. der Hefe P. pastoris durchführen und Assaymethoden für Hochdurchsatz-Screenings im Mikrotiterplattenformat entwickeln. Die Planung der Mutagenesen basiert auf der Kristallstruktur und der Lage des Substrates in den Bindungstaschen, gefolgt von Sättigungsmutagenesen und Durchmusterung der Varianten mit Hochdurchsatztests. Die im Mikrotiterplatten-Maßstab identifizierten Mutanten der CAL-A sollen anschließend im Labormaßstab in P. pastoris produziert werden, um eine eingehende biochemische Charakterisierung und eine Absicherung der Selektivitäten durch GC- bzw. HPLC-Analytik zu ermöglichen. Abschließend, sollen im Rahmen eines Unterauftrags mit einem KMU die besten Varianten im größerem Maßstab (30 L Fermentation) produziert und an Cognis für Anwendungstests übergeben werden.
Ergebnisdarstellung
Im Vorhaben wurden reaktionstechnische Untersuchungen zum Protein-Engineering von Enzymen und zum Einsatz dieser Enzyme für enzymatische Umesterungen durchgeführt. Schwerpunkte waren hierbei Optimierungen der Lipase A aus Candida antarctica (CAL-A) und der Einsatz der erhaltenen CAL-A-Varianten zur Abreicherung von gesättigten Fettsäuren aus Ölen oder auch zur Umesterung von natürlichen Ölen mit interessanten Alkoholkomponenten. Im Vorhaben wurde eine Assaymethode zur Bestimmung der Acyltransferase-Aktivität der CAL-A etabliert, die auf der Detektion des verbliebenen Alkohols beruht. Anschließend konnte mittels rationalem Proteindesign, basierend auf den Kristallstrukturen der CAL-A und der LipUms, fünf Mutagenesepositionen identifiziert werden (Aminosäurereste 118, 122, 183, 221 und 370). Die Aminosäuren an diesen Positionen wurden durch positionsgerichtete Mutagenese gegen hydrophobere ausgetauscht und die so erhaltenen CAL-A Varianten in E. coli exprimiert. Es wurden vier Varianten identifiziert (Thr118Ile, Asp122Leu, Tyr183Phe, Thr221Ala), die näher charakterisiert wurden. Diese vier Varianten wurden in P. pastoris exprimiert, was aber nur für die Varianten Thr118Ile, Asp122Leu und Thr221Ala erfolgreich war. Für diese Varianten konnte eine Expression im Bioreaktor im 0,5 L und 10 L in Zusammenarbeit mit der Enzymicals AG etabliert werden. In weiteren Untersuchungen konnte das geforderte verbesserte Verhältnis von gebildetem Ester zu freier Säure für die Variante Asp122Leu bestätigt werden. Diese Variante wurde daraufhin weiter charakterisiert. Es zeigte sich dabei, dass die Variante Asp122Leu sich in Bezug auf das pH-Profil, Temperaturoptimum und Thermostabilität sehr ähnlich zum CAL-A Wildtyp verhält. Im Folgenden wurden sowohl der Wildtyp als auch die Variante Asp122Leu immobilisiert und in weiteren Biokatalysen eingesetzt, wobei sich das verbesserte Verhältnis von Ester zu Säure für Asp122Leu erneut bestätigte.

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