Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe Ein Projektträger des Bundesministeriums für Ernährung und Landwirtschaft

 

Projektverzeichnis - Details

Verbundvorhaben: Enzymatische Lacton-Synthese - Teilvorhaben 1: Selektive, enzymkatalysierte Fettsäure-Hydroxylierung

Anschrift
Universität Stuttgart - Fakultät für Chemie - Institut für Biochemie und Technische Biochemie (IBTB)
Allmandring 31
70569 Stuttgart
Kontakt
Prof. Dr. Rolf D. Schmid
Tel: +49 711 685-31-93
E-Mail:
FKZ
22008603
Anfang
01.07.2004
Ende
31.03.2006
Ergebnisdarstellung
In der 21monatigen Förderphase wurde die grundsätzlichen Machbarkeit der folgenden Forschungsansätze nachgewiesen: 1. Regioselektive Hydroxylierung an den lactonrelevanten C-Atomen in mittelkettigen und/oder langkettigen Fettsäuren. 2. Elektrochemische Kopplung von Fettsäure-hydroxylierenden Monooxygenasen P450 BM-3 an ein elektronenlieferndes elektrochemisches System. Im Vorhaben der Universität Stuttgart wurde zur Hydroxylierung von Fettsäuren eine Cytochrom P450 Monooxygenase aus Bacillus megaterium (P450 BM-3 oder CYP102A1) gewählt. Diese Monooxygenase ist eine Fettsäure-Hydroxylase. Sie zeigt die höchste Aktivität gegenüber Fettsäuren, die jemals mit P450 Monooxygenasen gemessen wurde. Die erzeugten g- bzw. d-Hydroxyfettsäuren bilden unter geeigneten Reaktionsbedingungen (erhöhte Temperatur, saure Umgebung) spontan die jeweiligen Lactone. Mit den Methoden des rationalen Proteindesigns gelang die Verschiebung des Hydroxylierungsmusters in die gewünschte Richtung. Die Veränderung der Regioselektivität wird jedoch begleitet von einer Abnahme der Aktivität. Allerdings ist dies ein häufig beobachteter Effekt im Gebiet des Proteindesigns. Die Veränderung der Regioselektivität bei gleich bleibender Aktivität kann mit Methoden der gerichteten Evolution erzielt werden. Hierfür wird eine Bibliothek mehrer Tausend Mutanten durch Zufallsmutagenese erstellt, die dann mit einem Testsystem durchmustert werden. Grundlage für eine erfolgreiche Identifikation der Mutanten ist ein geeignetes Testsystem. Der im Projekt erarbeitete Farb-Assay basiert auf einem Prinzip, das bereits für Aktivitätsuntersuchungen bei Lipasen und P450 Monooxygenasen eingesetzt worden ist. Neu ist der Einsatz für die Optimierung der Regioselektivität von Hydroxylierungen.
Aufgabenbeschreibung
Das Gesamtziel des Vorhabens ist die Herstellung von Riech- und Aromastoffen des Lacton-Typs aus Ölen vornehmlich einheimischer Nutzpflanzen mittels regio- und stereoselektiver enzymatischer Oxidation mittel- und langkettiger Fettsäuren. Zum Einsatz kommen neuartige P450 Monooxygenasen, die mit Methoden der gerichteten Evolution und des rationalen Enzymdesigns erzeugt und auf die spezifischen Anforderungen des Vorhabens hin optimiert werden. Durch selektive Hydrolyse mittels rekombinanter Lipasen aus Candida rugosa werden Fettsäuren von bestimmten- Kettenlänge (z. B. C-12) selektiv abgespalten. Danach sollen diese Fettsäuren regio- und stereoselektiv hydroxiliert werden. Dafür werden die P450 Monooxygenasen durch gerichtete Evolution und Protein Designoptimiertwerden. Die erfolgversprechensten Monooxygenase-Fettsäure-Kombinationen werden aus den Screeningreihen mit verschiedenen Mutanten und Substraten ermittelt. Es sollen Publikation und Patentanmeldung erfolgen.

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