Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe Ein Projektträger des Bundesministeriums für Ernährung und Landwirtschaft

 

Projektverzeichnis - Details

ERA-IB: C. glutamicum als Plattform-Organismus für neue und effiziente Produktionsverfahren (BioProChemBB); Teilvorhaben 1: Konstruktion, Charakterisierung und Optimierung von Succinat-, Fumarat- und Malat-produzierenden C. glutamicum-Stämmen

Anschrift
Universität Ulm - Fakultät für Naturwissenschaften - Fachrichtung Biologie - Abt. für Mikrobiologie und Biotechnologie
89081 Ulm
Albert-Einstein-Allee 11
Kontakt
Prof. Dr. Bernhard Eikmanns
Tel: +49 731 50-22707
E-Mail: bernhard.eikmanns@uni-ulm.de
FKZ
22009508A
Anfang
01.03.2009
Ende
31.08.2012
Aufgabenbeschreibung
Corynebacterium glutamicum wird seit Jahrzehnten erfolgreich für die biotechnologische Produktion von Aminosäuren eingesetzt. Aufgrund der nachgewiesenen Eignung für die großtechnische Produktion hat sich C. glutamicum zu einem wichtigen Modellorganismus in der Weißen Biotechnologie entwickelt. Das Gesamtvorhaben des ERA-IB-Projektes zielte darauf ab, C. glutamicum in iterativen Optimierungsverfahren für die Gewinnung von Grundchemikalien und Synthesebausteinen im Sinne der Weißen Biotechnologie aus nachwachsenden Rohstoffen zu nutzen und robuste sowie kostensparende Fermentations- und „Downstream processsing"-Verfahren zu entwickeln. Dabei standen die Produkte Succinat, Fumarat, Malat, Aspartat und Itaconat im Projektfokus. Das Ziel des Teilprojektes 1 war die Konstruktion, Analyse und iterative Optimierung von C. glutamicum-Stämmen, die mit hoher Ausbeute und hoher Produktionsrate Succinat, Fumarat und/oder Malat (bzw. deren Säuren) aus nachwachsenden Rohstoffen (Zucker) produzieren. Die zentrale Vorstufe aller drei Säuren im Zentralstoffwechsel von C. glutamicum ist Pyruvat, selbst ein attraktives Produkt als Vorstufe verschiedener Chemikalien und Polymere sowie als Bestandteil oder Zusatz in Nahrungsmitteln, Kosmetika und Pharmazeutika. Aus diesem Grund sollte auch zunächst ein C. glutamicum-Stamm entwickelt und analysiert werden, der effizient Pyruvat bildet. Succinat ist eine Plattform-Chemikalie, aus aus der eine Reihe bisher petrochemisch hergestellter „Bulk"-Chemikalien synthetisiert werden können, wie z.B. 1,4-Butandiol, Tetrahydrofuran, Adipinsäure, g-Butyrolacton oder lineare aliphatische Esther. Fumarat wird in der Nahrungsmittelindustrie und als Ausgangsverbindung für Polymerisierungs- und Estherifizierungsreaktionen genutzt, Malat wird in der pharmazeutischen Industrie, in der Kosmetik- und in der Nahrungsmittelindustrie eingesetzt und wird wie Succinat und Fumarat als vielversprechender chemische Grundbaustein für Plattformchemikalien angesehen.
Ergebnisdarstellung
Durch gezielte Geninaktivierungen wurde zunächst ein Pyruvat-produzierender Stamm von C. glutamicum mit abgeschaltetem Citratzyklus und inaktivierter Lactat- und Acetatbildung konstruiert. Dieser Stamm schied neben 50 mM Pyruvat 30 mM Alanin und 20 mM Valin aus. Die Inaktivierung der Valinbiosynthese und das Ausschalten von Aminotransferasen führte im Stamm C. glutamicum Delta-aceE Delta-pqo Delta-ldhA Delta-C-T ilvN Delta-alaT Delta-avtA (im Folgenden als Stamm ELB-P01 bezeichnet) zu etwa 200 mM Pyruvat mit einem Ertrag (YP/S) von 1,45 Mol/Mol Glucose und drastisch reduzierter Nebenproduktbildung. In einer Fed-Batch-Fermentation schied der Stamm mehr als 500 mM Pyruvat mit einem YP/S von 0,97 Mol/Mol Glucose und einer Produktivitat von 0,92 mMol g(TG)-1 h-1 aus. Für die Produktion von Succinat wurden in C. glutamicum ELB-P01 die Gene fur anaplerotische Enzyme überexprimiert, der resultierende Stamm schied etwa 80 mM Succinat aus. Der Einatz von Bicarbonat erhöhte die Succinatproduktion auf über 150 mM mit einem YP/S von 0,98 Mol/Mol Glucose. In Fed-Batch Fermentationen mit aerober Wachstumsphase und anaerober Produktionsphase wurden über 350 mM Succinat mit einem YP/S von 1,03 Mol/Mol Glucose erreicht. Eine Verschiebung des C-Flusses von der Glycolyse in den Pentosephosphatweg durch Expression von Genen für deregulierte Enzyme führte zu einer weiteren Erhöhung des Ertrages auf 1,07 Mol/Mol Glucose. Die Konstruktion einer ersten Generation von Modellstämmen für die Malat- und Fumaratproduktion war erfolgreich, jedoch schieden die Stamme nicht mehr als 25 mM dieser Produkte aus. Alle Versuche, die Malat- und Fumaratproduktion weiter zu verbessern, waren erfolglos. Ausgehend von C. glutamicum ELB-P01 wurden Isobutanol-produzierende Stämme von C. glutamicum konstruiert. Der beste Stamm produzierte 175 mM mit einem YP/S von 0,48 Mol/Mol Glucose.

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