Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe Ein Projektträger des Bundesministeriums für Ernährung und Landwirtschaft

 

Projektverzeichnis - Details

ERA-IB: C. glutamicum als Plattform-Organismus für neue und effiziente Produktionsverfahren (BioProChemBB); Teilvorhaben 2: Konstruktion, Charakterisierung und Optimierung von C. glutamicum-Stämmen zur Produktion von Aspartat und abgeleiteten Biomonomeren

Anschrift
Universität Bielefeld - Fakultät für Biologie
33615 Bielefeld
Universitätsstr. 25
Kontakt
Prof. Dr. Volker Wendisch
Tel: +49 521 106-5611
E-Mail: volker.wendisch@uni-bielefeld.de
FKZ
22009508B
Anfang
01.03.2009
Ende
31.12.2012
Aufgabenbeschreibung
Corynebacterium glutamicum wird seit Jahrzehnten erfolgreich für die biotechnologische Produktion von mehr als drei Millionen Tonnen Aminosäuren pro Jahr eingesetzt. Aufgrund der nachgewiesenen Eignung für die großtechnische Produktion hat sich C. glutamicum zu einem intensiv beforschten Modellorganismus in der Weißen Biotechnologie entwickelt. Das Ziel des ERA-IB-Verbundprojektes BioProChemBB bestand darin, C. glutamicum zu einem Plattform-Organismus weiterzuentwickeln, der nicht nur für die Produktion von Aminosäuren, sondern auch anderer industriell relevanter Produkte aus nachwachsenden Rohstoffen eingesetzt werden kann. Im Fokus von BioProChemBB standen dabei verschiedene Dicarbonsäuren, die im Rahmen einer Studie des U.S. Department of Energy als vielversprechende chemische Bausteine aus nachwachsenden Rohstoffen identifiziert worden waren. Das Ziel des Teilprojekts 2 war die Konstruktion und Charakterisierung von C. glutamicum-Stämmen zur Produktion von Aspartat und sich davon ableitender Biomonomere. Bisher wird L- Aspartat als Ausgangsstoff für die Produktion des Süßstoffs Aspartam benutzt. Aspartat kann jedoch auch als Ausgangsstoff für die Synthese von Aminoderivaten der in den großen Polymer- und Lösungsmittelmärkten genutzten Grundchemikalien Butanediol, Tetrahydrofuran oder Butyrolakton dienen. Im Teilprojekt 2 wird zunächst bei der Stammentwicklung die Umsetzung von Aspartat zu Lysin unterbrochen und die Bereitstellung der Kohlenstoffvorläufer verbessert. Eine direkte Umsetzung von Fumarat zu Aspartat wird durch heterologe Expression eines Aspartasegens ermöglicht. Die aerobe und anaerobe Asparatproduktion soll verglichen werden. Zur Verbesserung der Stämme der ersten Generation sollen funktionelle Genomanalysen eingesetzt werden. Ausgehend von Aspartatproduktionsstämmen sollen Stämme entwickelt werden, die von Aspartat abgeleitete Biomonomere produzieren.
Ergebnisdarstellung
Die anaerobe Produktion von Aspartat gelang durch "metabolic engineering" von C. glutamicum. Dieursprünglich geplante Deletion oder Reduktion des Gens für die Aspartatkinase war nicht erfolgreich,was wahrscheinlich auf dessen essentielle Funktion zurückzuführen ist. Eine aerobe Aspartatproduktion mithilfe der Aspartase gelang ebenfalls nicht. Die Etablierung einer anaerobenProduktion von Aspartat gelang in Stämmen mit Deletionen der Gene ldhA und sdhCAB. Alanin als Nebenprodukt konnte durch Deletion des Transaminase-Gens avtA reduziert werden und verschob das Produktspektrum zugunsten von Aspartat. Es stellte sich als entscheidend heraus, die richtigen Kultivierungsbedingungen und die richtige Medienrezeptur zu entwickeln. Es zeigte sich, dass Nitrat zwar den Glucoseumsatz erhöhte, allerdings nur zu Gunsten der Alaninbildung. Auf der anderen Seite begünstigte die Zugabe von Carbonat die Aspartatbildung. Schließlich verbesserte die Überexpression des endogenen Aspartattransaminase-Gens aspB die Aspartatproduktion. Somit gelang die anaerobe Produktion von 45 mM Aspartat ausgehend von Medium mit 50 mM Glucose. Die zusätzliche Deletion von einer Reihe von Genen mit dem Ziel die Nebenproduktbildung zu vermindern und die Vorläuferbereitstellung zu verbessern, führten zu keiner weiteren Stammverbesserung. Die nicht-proteinogene Aminosäure -Alanin leitet sich durch Decarboxylierung von Aspartat ab. Wesentlich zur Etablierung der Produktion von -Alanin war die Überexpression des Gens für die endogene Aspartatdecarboxylase, panD. Ausgehend von einem Stamm für die anaerobe Aspartat- Produktion gelang die Produktion von -Alanin. Allerdings produzierte der -Alanin-Produktionsstamm immer noch erhebliche Mengen an Aspartat und nur 5 bis 10 mM -Alanin. Ectoin leitet sich in drei enzymatischen Schritten aus Asparat ab. Ein Lysin-Produktionsstamm wurde durch Überexpression des ectABC-Operons aus Chromohalobacter salexigens in einen Ectoin-Produzenten umgewandelt. Dabei gelang di

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