Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe Ein Projektträger des Bundesministeriums für Ernährung und Landwirtschaft

 

Projektverzeichnis - Details

Herstellung von Poly(asparaginsäure) durch Biotransformation von Cyanophycin

Anschrift
Westfälische Wilhelms-Universität Münster - Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät - Fachbereich 13 Biologie - Institut für Molekulare Mikrobiologie und Biotechnologie
Corrensstr. 3
48149 Münster
Kontakt
Prof. Dr. Alexander Steinbüchel
Tel: +49 251 83-39821
E-Mail: steinbu@uni-muenster.de
FKZ
22011904
Anfang
01.04.2005
Ende
31.03.2006
Ergebnisdarstellung
Aus Bakterienstämmen von F. johnsoniae wurden Lysate erhalten, die Cyanophycine mit unterschiedlichem Lysinanteil zu PAA abbauen. In einigen unvollständig abgebauten Cyanophycin-Proben konnte so auch zum ersten Mal noch im Polymer vorhandene Restmengen an Arginin gefunden werden. In Kulturüberständen der Cyanophycin abbauenden Stämme konnte zu keiner Zeit der durchgeführten Experimente, freies Arginin aus der Spaltung gefunden werden, so dass von einer sehr effizienten Verwertung des freigesetzten Arginins durch die Bakterienzellen ausgegangen werden kann. Durch die vergleichsweise geringen Wachstumsraten von F. johnsoniae in Cyanophycin-haltigen Nährmedien standen auch nur geringe Mengen an gebildeten extrazellulären Proteinen (Abbauenzymen) zur Verfügung. Darüber hinaus erfolgte in verschiedenen für die Enzymreinigung eingesetzten Puffern eine vergleichsweise rasche Inaktivierung der Dearginase-Aktivität, die eine Reinigung des Enzyms stark erschwerte. Da die Gesamtproteinmenge in den untersuchten Proben in allen Fällen zudem äußerst gering war, waren die Aktivitätsverluste während der Proteinreinigung insgesamt sehr hoch, und die Ursache der Inaktivierung ließ sich daher bisher nicht klären. Gegenüber der ursprünglichen Planung trat somit eine deutliche zeitliche Verzögerung bei der Reinigung der Cyanophycin-Dearginase ein, da Rohpräparate des Enzyms aufgrund der geringen Aktivität und des langsamen Wachstums der Zellen nicht in dem erwarteten Umfang für die Untersuchungen zur Verfügung standen. Die geringen Mengen gebildeter extrazellulärer Proteine in den Cyanophycin-Abbaukulturen sowie die geringen Wachstumsraten der Abbauisolate auf Cyanophycin machten es erforderlich, die Abbaugene von F. johnsoniae zu identifizieren und heterolog in einem schneller wachsenden und produktiveren Bakterienstamm zu exprimieren. Die Konstruktion entsprechender rekombinanter Bakterienstämme steht noch aus.
Aufgabenbeschreibung
Cyanophycin ist ein in Bakterien vorkommender, aus Aspartat und Arginin bestehender polymerer Speicherstoff mit Polyaspartat (PAA) als Polymerrückgrat. Zur Umwandlung von Cyanophycin in PAA wurden Bakterien angereichert,die mittels Cyanophycin-Dearginasen (CDA) spezifisch nur die Abspaltung der Argininseitenketten katalysieren. Diese CDA sollen biochemisch und molekulargenetisch charakterisiert und dann gezielt zur biotechnologischen Produktion von bisher nur durch chemische Prozesse zugänglichem und als Ersatz für Polyacrylsäure vorgesehenem PAA eingesetzt werden. Von vorliegenden Bakterienstämmen sollen CDA mittels chromatographischer Methoden gereinigt werden. Die CDA sollen biochemisch charakterisiert und deren Strukturgene kloniert werden. Basierend hierauf soll ein Prozess zur Herstellung von CDA im präparativen Maßstab entwickelt werden. Mit gereinigter CDA soll ein enzymatischer Prozess zur Umwandlung von Cyanophycin in PAA entwickelt werden.

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