Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe Ein Projektträger des Bundesministeriums für Ernährung und Landwirtschaft

 

Projektverzeichnis - Details

ERA-IB: C. glutamicum als Plattform-Organismus für neue und effiziente Produktionsverfahren (BioProChemBB); Teilvorhaben 4: Konstruktion und Charakterisierung von C. glutamicum-Stämmen zur Produktion von Succinat und Itaconat

Anschrift
Forschungszentrum Jülich GmbH - Institut für Biotechnologie 1
52428 Jülich
Wilhelm-Johnen-str.
Kontakt
Prof. Michael Bott
Tel: +49 2461 61-3294
E-Mail: m.bott@fz-juelich.de
FKZ
22009508D
Anfang
01.03.2009
Ende
31.08.2012
Aufgabenbeschreibung
Corynebacterium glutamicum wird seit Jahrzehnten erfolgreich für die biotechnologische Produktion von mehr als drei Millionen Tonnen Aminosäuren pro Jahr eingesetzt. Aufgrund der nachgewiesenen Eignung für die großtechnische Produktion hat sich C. glutamicum zu einem intensiv beforschten Modellorganismus in der Weißen Biotechnologie entwickelt. Das Ziel des ERA-IB-Verbundprojektes BioProChemBB bestand darin, C. glutamicum zu einem Plattform-Organismus weiterzuentwickeln, der nicht nur für die Produktion von Aminosäuren, sondern auch anderer industriell relevanter Produkte aus nachwachsenden Rohstoffen eingesetzt werden kann. Im Fokus von BioProChemBB standen dabei verschiedene Dicarbonsäuren, die im Rahmen einer Studie des U.S. Department of Energy als vielversprechende chemische Bausteine aus nachwachsenden Rohstoffen identifiziert worden waren. Das Ziel des vorliegenden Teilprojekts 4 war die Konstruktion und Charakterisierung von C. glutamicum-Stämmen zur Produktion von Succinat und Itaconat. Succinat ist eine Plattform- Chemikalie, aus der eine Reihe bisher petrochemisch hergestellter "Bulk"-Chemikalien synthetisiert werden können, wie z. B. 1,4-Butandiol, Tetrahydrofuran oder g-Butyrolacton. Itaconat ist eine ungesättigte C5-Dicarbonsäure, die unter anderem für die Herstellung von Polymeren von Interesse ist und z. B. petrochemisch erzeugtes Acrylat oder Methylacrylat ersetzen könnte. Für die Succinat-Produktion sollten sowohl die aerobe als auch die anaerobe Herstellung aus Glucose sowie aus Glycerin, einem Nebenprodukt der Biodiesel-Herstellung, etabliert werden. Die entsprechenden Stämme sollten rational über "metabolic engineering" konstruiert werden, basierend auf dem umfangreichen Wissen zum Stoffwechsel und seiner Regulation in C. glutamicum. Für die Itaconat-Produktion sollte erstmals ein bakterieller Produktionsstamm entwickelt werden, der Vorteile gegenüber dem natürlichen Produzent Aspergillus terreus bieten könnte.
Ergebnisdarstellung
Für die aerobe Succinat-Produktion aus Glucose wurde eine Serie von 5 Stämmen konstruiert und charakterisiert. Wesentliche Voraussetzung war die Deletion der Gene für die Succinat- Dehydrogenase sowie der Gene, die zur Bildung von Acetat führen. Des Weiteren wurde der anaplerotische Fluss zu Oxalacetat durch Überexpression der Gene für die Pyruvat-Carboxylase und die PEP-Carboxylase verbessert. Die beste Succinat-Produktion in einer batch-Kultivierung wurde unter Wachstums-limitierten Bedingungen erreicht. Dabei wurden 90 ± 5 mM Succinat mit einer Ausbeute von 0.45 mol/mol Glucose gebildet. Durch Transformation mit dem Plasmid pVWEx1- glpFKD, das Glycerin-Verwertungsgene von E. coli trägt, konnte auch Glycerin als Kohlenstoffquelle für die Succinat-Produktion verwendet werden. Dabei wurden bis zu 79 mM Succinat mit einer Ausbeute von 0.21 mol/mol und einer hohen volumetrischen Aktivität gebildet. Für die anaerobe Succinat-Produktion aus Glucose wurde ein Stamm konstruiert, bei dem die Gene für die NAD-abhängige L-Lactat-Dehydrogenase sowie für die Acetat-bildenden Enzyme deletiert waren. Die Gene für eine verbesserte Pyruvat-Carboxylase sowie für eine NAD-abhängige Formiat- Dehydrogenase wurden chromosomal unter der Kontrolle eines starken Promotors integriert. Fedbatch-Fermentationen dieses Stammes mit Glucose, Formiat und NaHCO3 erlaubten die Bildung von 1130 mM Succinat (130 g/l) in 53 h mit einer Ausbeute von 1,67 mol/mol Glucose (ohne Berücksichtigung von Formiat und HCO3-) und einer relativ geringen Menge an Nebenprodukten. Für die Itaconat-Produktion wurde Gen für die cis-Aconitat-Decarboxylase (CAD) aus Aspergillus terreus in C. glutamicum exprimiert. Durch Austausch des ATG-Startcodons des icd-Gens gegen GTG bzw. TTG konnte die Isocitrat-Dehydrogenase-Aktivität stark reduziert und dadurch die Itaconat- Produktion verbessert werden. Ebenso führte die Fusion des CAD-Proteins mit dem Maltosebindeprotein von E. coli zu einer verbesserten Itaconat-Produktion. U

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