Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe Ein Projektträger des Bundesministeriums für Ernährung und Landwirtschaft

 

Projektverzeichnis - Details

Optimierung der Synthese von Monoterpenen und Monoterpensäuren aus Glycerin in produkttoleranten Mikroorganismen zur Gewinnung natürlicher Wirkstoffe für die Agro- und Kosmetikindustrie

Anschrift
DECHEMA Forschungsinstitut
60486 Frankfurt am Main
Theodor-Heuss-Allee 25
Kontakt
Dr. Dirk Holtmann
Tel: +49 69 7564-610
E-Mail: holtmann@dechema.de
FKZ
22016513
Anfang
01.12.2013
Ende
31.08.2015
Aufgabenbeschreibung
Ziel des Vorhabens ist die Optimierung der mikrobiellen Synthese von Monoterpenen sowie deren Säurederivaten ausgehend von Glycerin zur Gewinnung natürlicher Wirkstoffe für die Agro- und Kosmetikindustrie. Von zentraler Bedeutung ist dabei das Bodenbakterium Pseudomonas putida. Einige P. putida Stämme sind lösemitteltolerant und können hohe Konzentrationen der für andere Mikroorganismen toxischen Monoterpene tolerieren. P. putida eignet sich aufgrund dieser physiologischen Konstitution, seiner guten Kultivierbarkeit bis zur Hochzelldichte und seiner molekularbiologischen Zugänglichkeit als vielversprechender Kandidat für die de novo Synthese von Monoterpenen und deren Säuren. Mit dem geplanten Vorhaben soll das innerhalb der ersten Förderphase etablierte System zur de novo Terpen(säure)produktion basierend auf P. putida mit Hilfe molekularbiologischer und verfahrenstechnischer Methoden deutlich weiter optimiert werden, so dass am Ende des Vorhabens eine erste Abschätzung des wirtschaftlichen Potenzials der neuen Produktionsstrategie möglich ist. Der Schwerpunkt der Arbeiten liegt dabei sowohl auf der weiteren Steigerung der intrazellulären Vorstufen- und Monoterpensynthese sowie der Verstärkung der weiterführenden Oxidationsreaktionen, d.h. von Limonen zu Perillasäure bzw. von Geraniol zur Geraniumsäure. Die molekularbiologisch erzeugten Stämme werden abschließend für eine Bewertung des wirtschaftlichen Potenzials unter Bioprozessbedingungen charakterisiert.
Ergebnisdarstellung
Überexpression von Enzymen des DXP-Wegs führt nicht zur Steigerung der Perilla- oder Geraniumsäurekonzentrationen bei der de novo Synthese in P. putida GS1. Die heterologe Expression des MVA-Wegs stellte sich als vielversprechendste Lösung zur Steigerung der Produktkonzentrationen heraus. Die P. putida GS1 eigene Kapazität zur Oxidation von Limonen zu Perillasäure und Geraniol zu Geraniumsäure ist nicht der limitierende Schritt bei der de novo Synthese von Perillasäure oder Geraniumsäure. Eine in situ Abtrennung der Geraniumsäure ist mittels Anionenaustauscher möglich. Die bei der de novo Synthese erreichten Produktkonzentrationen sind jedoch noch unterhalb der Toxizitätsgrenze von P. putida GS1, daher ist eine Einbindung der in situ Produktabtrennung noch nicht notwendig. Die erfolgreiche Konstruktion des Expressionsvektors pMiS4 mit geringerer metabolischer Last für P. putida GS1 oder KT2440 im Vergleich zu pMiS1 ist ein wichtige Voraussetzung für die weitere Steigerung der Produktkonzentrationen. Konstruktion von pMiS1.1 MVA Lim und pMiS4.1 MVA Lim als optimierte Expressionsvektoren mit Genen des MVA-Wegs. Mit pMiS4.1 MVA Lim transformierte P. putida GS1 Zellen bilden die ca. 2,3-fache Menge an Perillasäure im Vergleich zu P. putida GS1 Zellen, die mit pMiS4.1 MVA Lim transformiert wurden. Die Konzentrationen an de novo produzierter Perillasäure konnte im Vergleich zum vorhergehenden Berichtzeitraum um ca. den Faktor 9 auf 40 µM gesteigert werden. Über die Laufzeit des Vorhabens wurde eine stetige Steigerung der Produktkonzentrationen erreicht bis zu einer Geraniumsäurekonzentration von 193 mg/L auf Basis der Überexpression von Genen des MVA-Wegs bei Fed-batch Kultivierung im Bioreaktor.

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