Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe Ein Projektträger des Bundesministeriums für Ernährung und Landwirtschaft

 

Projektverzeichnis - Details

ERA-IB 5: Optimierte Laccase-Systeme für die Herstellung hochwertiger Biokunststoffe aus Biomasse (OXYPOL)

Anschrift
Autodisplay Biotech GmbH
40225 Düsseldorf
Merowingerplatz 1 a
Kontakt
Dr. Eva Kranen
Tel: +49 211-99459-609
E-Mail: eva.kranen@autodisplay-biotech.com
FKZ
22031414
Anfang
01.04.2015
Ende
30.06.2018
Aufgabenbeschreibung
Ziel des Projektes Optimierte Laccase-Systeme für die Herstellung hochwertiger Biokunststoffe aus Biomasse (OXYPOL) war die Entwicklung eines kosteneffizienten biokatalytischen Herstellungsprozesses für (neue) Bio-Plastiken aus pflanzlichen Rohstoffen. Im Rahmen des Projektes OXYPOL sollten dafür einerseits toxische Katalysatoren durch umweltverträgliche Biokatalysatoren ersetzt werden, andererseits wurde anstelle von Stärke als natürlichem Rohstoff hier Lignin verwendet. Mithilfe von Laccasen und optimierten Laccase/Mediator-Systemen sollte das Lignin zuerst biokatalytisch depolymerisiert werden. Anschließend sollten die entstandenen Monomere biokatalytisch mit Hilfe von Lipasen sowie auf synthetisch-chemischem Weg neu polymerisiert werden. Die Aufgabe der Autodisplay Biotech GmbH innerhalb des OXYPOL-Projektes bestand darin, eine für die Polymerisierungsreaktion geeignete Lipase auf der Zelloberfläche zu exprimieren. Außerdem sollten Laccasen durch die Zelloberflächen-Expression bereitgestellt werden. Die Präsentation der Enzyme auf der Zelloberfläche bietet die Möglichkeit, diese Enzyme nach einer Markierung durchflusszytometrisch zu untersuchen. Im Rahmen des Projekts sollte ein spezielles high throughput Screening entwickelt werden, welches eine Selektion optimierter Laccasen nach einer zielgerichteten evolutiven Optimierung erlaubt.
Ergebnisdarstellung
Die Gene aller Enzyme konnten erfolgreich kloniert und die Enzyme anschließend auf der Oberfläche von E. coli exprimiert werden. Die auf der Oberflächen-exprimierte Lipase zeigte gute Aktivitäten gegenüber einem Testsubstrat. Um die Aktivität der Laccasen nachweisen zu können, musste zunächst die Hintergrundaktivität des Wirtsstammes E. coli bereinigt werden. Die Enzyme wurden aus diesem Grund in einer speziellen Variante eines E. coli-Wirtsstammes exprimiert. Alle ausgewählten Laccasen – 2 Enzyme aus Bacillus-Stämmen, ein Enzym aus T. thermophilus, sowie ein Enzym aus einer Metagenomuntersuchung und dessen optimierte Varianten wurden so auf Expression und Aktivität gegenüber dem Testsubstrat untersucht. Dabei zeigte sich, dass nach der Expression auf der Zelloberfläche nur die Enzyme aus Bacillus Laccase-Aktivität aufwiesen. Das bessere dieser beiden Enzyme wurde deshalb zur Etablierung des Screening-Systems ausgewählt. Um bestmögliche Voraussetzungen für das Screening zu schaffen wurden die Expressionsbedingungen optimiert und der Aktivitätstest dahingehend angepasst, dass optimale Bedingungen für ein Screening und anschließendes Sortieren der Zellen vorlagen. Die Markierung für dieses neu entwickelte Screening-System basierte auf einer Aktivierung des Markermoleküls durch die Laccase. Nach Optimierungen der Markierungsreaktion war es zunächst gelungen, aktive Zellen zu markieren. Bei weiteren Untersuchungen bezüglich einer möglichen Sortierung kam es jedoch zu bislang ungeklärten Schwierigkeiten hinsichtlich der Genauigkeit der Markierung. Das Screening konnte so im Rahmen der Projektlaufzeit nicht mehr vollständig etabliert werden. Somit konnte das Screening auch nicht mehr zur Selektion besserer Laccasen nach evolutiven Maßnahmen angewandt werden. Da die Zellen aber eindeutige Laccase-Aktivität zeigten, waren sie zu der Universität von Oviedo geschickt worden um dort in Untersuchungen mit neu entdeckten und entwickelten Laccase-Mediatoren eingesetzt zu werden.

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